pNaSS 通過臭氧化和接枝聚合接枝到PCL表面研究

        聚苯乙烯磺酸鈉（pNaSS）通過臭氧化和接枝聚合接枝到聚（ε-己丙酮）（PCL）表面。研究了臭氧化和聚合時間以及接枝液中莫爾鹽濃度對接枝程度的影響。通過甲苯胺藍(lán)染色確定接枝程度。采用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）、能量色散X射線光譜（EDX）和X射線光電子能譜（XPS）對表面化學(xué)變化進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，該接枝不會誘導(dǎo)PCL降解，并且pNaSS作為薄的共價穩(wěn)定層嫁接到PCL上。此外，改性的PCL表面顯示成纖維細(xì)胞的代謝活性顯著增加，以及更好的細(xì)胞擴(kuò)散和更高的粘附強(qiáng)度。因此，通過將一層薄薄的pNaSS固定在其表面上，PCL的生物活性大大增強(qiáng)。pNaSS的接枝是一種很有前途的方法，可以提高組織工程應(yīng)用（如韌帶重建）中使用的PCL基材料的生物活性。

1 引言

        組織工程的主要目標(biāo)之一是開發(fā)可生物降解的支架，允許細(xì)胞在三維結(jié)構(gòu)中粘附、增殖和分化。如果生物降解性方面通常促使選擇α-羥基聚酯作為支架基質(zhì)：脂肪族聚酯的主要缺點是缺乏促進(jìn)良好細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)。為了克服聚酯材料遇到的化學(xué)成分問題，人們提出了多種改變材料表面的方法：通過表面處理引入極性基團(tuán)、吸附生物分子和生物活性化合物的共價固定化[1\u20125]。與生物分子可以快速解吸的吸附方法相比，很后一種方法具有提高生物相容性的優(yōu)點，同時具有一定的耐久性。然而，有許多因素會影響生物分子如何拴在表面，從而影響其生物活性[1]。此外，當(dāng)使用糖胺聚糖等生物分子時，由于其異質(zhì)性，很難理解生物分子對細(xì)胞增殖的影響。事實上，分子量、凈電荷和離子基團(tuán)分布的分散性可以顯著影響生物反應(yīng)[1,3]。此外，生物分子固定化的成本和控制仍然是控制細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。因此，引入官能團(tuán)是改變底物的電荷或化學(xué)組成表面的更簡單方法，因此可以調(diào)節(jié)從細(xì)胞培養(yǎng)血清吸附到底物表面的蛋白質(zhì)的重排[6]。

        通過陰離子和親水性單體的接枝共聚來改性聚酯是一種眾所周知的增強(qiáng)體外和體內(nèi)細(xì)胞行為的通用方法。硫酸化大分子或單體已被廣泛用于設(shè)計具有良好血液相容性和抗凝活性的聚合物生物材料[7]。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)，將聚苯乙烯磺酸鈉（pNaSS）嫁接到聚乙烯基質(zhì)上導(dǎo)致HeLa S3[8]和中國倉鼠卵巢細(xì)胞[9]的高度粘附。Kishida等[8]認(rèn)為，靠近可電離磺酸鹽基團(tuán)的芳環(huán)的存在允許高蛋白吸附到pNaSS表面。很近，我們的研究小組證明，當(dāng)pNaSS從聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）基合成韌帶移植時，pNaSS允許更強(qiáng)的成纖維細(xì)胞粘附，更好的細(xì)胞擴(kuò)散，更均勻的細(xì)胞分布在材料表面，并增加細(xì)胞膠原分泌[10\u201211]。當(dāng)pNaSS從非聚合物生物材料表面接枝時，觀察到相同的效果[12\u201215]。事實上，當(dāng)pNaSS從鈦表面接枝時，與天然鈦表面相比，蛋白質(zhì)吸附水平增加，吸附的蛋白質(zhì)也受到選擇性調(diào)節(jié)[12]。此外，MG63 [13] 或人間充質(zhì)干細(xì)胞 [14] 的粘附及其在 pNaSS 移植表面上的擴(kuò)散得到增強(qiáng)。此外，在pNaSS接枝表面發(fā)現(xiàn)了更好的堿性磷酸酶ALP活性和礦化，強(qiáng)調(diào)了pNaSS對成骨細(xì)胞分化的影響[14]。很后，當(dāng)基于PET的合成韌帶植入綿羊模型進(jìn)行前交叉韌帶重建時，pNaSS移植增強(qiáng)了韌帶與骨的直接接觸，減少了骨/韌帶界面的纖維瘢痕組織[11,16]。因此，將pNaSS固定在組織工程應(yīng)用中使用的三維支架中，特別是在韌帶重建中，可以有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)，并且似乎是更復(fù)雜生物分子共價固定的良好替代方案。

        然而，苯乙烯磺酸鈉（NaSS）是一種陰離子乙烯基單體，由于被大水合球包圍的高度電離磺酸基團(tuán)與疏水性聚合物主鏈之間不相容，因此以其較差的聚合動力學(xué)而聞名[17]。到目前為止，pNaSS尚未共價嫁接到基于聚（ε-己內(nèi)酯）（PCL）等合成聚酯的可生物降解支架上，除非我們小組很近的初步研究[18\u201219]。事實上，由于PCL是一種半結(jié)晶可生物降解聚合物，具有較低的特征溫度（玻璃化轉(zhuǎn)變溫度約為-60°C，熔點溫度在59至64°C之間[20–21]），因此只能在溫和的條件下進(jìn)行接枝，以避免PCL的降解以及熱和機(jī)械性能的劇烈變化。因此，需要開發(fā)一種通用策略，允許從PCL中有效接枝pNaSS，同時保持pNaSS的生物活性和基于PCL的生物材料的內(nèi)在特性。

        本研究研究了NaSS在PCL薄膜上的接枝聚合，研究了在各種反應(yīng)參數(shù)下進(jìn)行的接枝聚合：臭氧化和聚合時間，以及接枝液中莫爾鹽的濃度。通過潤濕性測量、衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）、能量色散X射線光譜（EDX）和X射線光電子能譜（XPS）證明了pNaSS接枝的證據(jù)。通過甲苯胺藍(lán)染色確定接枝程度。通過測量細(xì)胞代謝活性和形態(tài)的體外測定評估了pNaSS接枝對成纖維細(xì)胞行為的影響。

2 材料與方法

2.1 材料

        PCL是從Sigma-Aldrich獲得的。NaSS （Sigma-Aldrich） 在蒸餾水/乙醇溶液 （10/90 % （v/v）） 中重結(jié)晶純化。使用莫爾鹽、碘化鉀和甲苯胺藍(lán) （BT） （Sigma-Aldrich） 未經(jīng)任何純化。所有溶劑均從Fisher購買，并按原樣使用。磷酸鹽緩沖鹽水溶液 （PBS）、Dulbecco 改良鷹培養(yǎng)基 （DMEM）、青霉素-鏈霉素 （PenStrep） 和胎牛血清 （FBS） 由 Gibco 提供。MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鹽）、鬼筆環(huán)肽-FITC和Hoechst 33258購自Sigma。McCoy成纖維細(xì)胞購自ATCC（CRL-1696，美國）。

2.2 PCL薄膜的制備和pNaSS的接枝

        這些薄膜是使用旋涂法制造的。將二氯甲烷（60%（w / v））中的PCL溶液滴入載玻片上，然后使用SPIN150-v3 SPS以1500rpm旋轉(zhuǎn)30秒。將薄膜風(fēng)干2小時，然后真空干燥24小時以除去溶劑，很后將它們切成直徑為~15.5mm的小圓盤。

        對于pNaSS接枝，將薄膜在室溫下攪拌到蒸餾水中懸浮。臭氧發(fā)生器BMT 802N（ACW）產(chǎn)生臭氧，壓力為0.5 bar，氧氣流速為0.6 L min−1.臭氧化后，將PCL薄膜轉(zhuǎn)移到含有莫爾鹽的蒸餾水（15%（w/v））中的脫氣NaSS溶液中。將系統(tǒng)保持在45°C以允許接枝聚合發(fā)生。聚合后，將樣品用蒸餾水洗滌過夜，很后真空干燥。薄膜通過連續(xù)浸泡滅菌和制備，如下所示：在70%乙醇中2小時，在無菌PBS溶液中2小時，在DMEM中1小時，在完全培養(yǎng)基中1小時。

2.3 臭氧化和聚合后接枝pNaSS產(chǎn)生的過氧化物的定量測定

        PCL薄膜中臭氧化產(chǎn)生的過氧化物量通過分光光度法（碘化物法）測定[22]。將兩片薄膜置于1 mL異丙醇和7 mL含有1 ppm-氯化鐵的碘化鉀溶液中，并在45°C下保持10分鐘。反應(yīng)后，立即使用分光光度計（Perkin Elmer Lambda 25）測量溶液在360nm處的吸光度，通過跟蹤三碘化物陰離子濃度來測量氧化碘。該方法通過使用過氧化苯甲酰進(jìn)行校準(zhǔn)。過氧化物的密度以過氧化物摩爾/厘米表示2PCL薄膜。

通過BT與pNaSS磺酸基團(tuán)的絡(luò)合，通過比色法測定嫁接到PCL薄膜上的pNaSS的量。簡而言之，將一層薄膜置于5mL BT溶液中，并在30°C下保持6小時。反應(yīng)后，將絡(luò)合的BT在室溫下在10 mL乙酸溶液（50%（v））中解絡(luò)24小時。此后，使用分光光度計（Perkin Elmer Lambda 25）在633nm處測量溶液的吸光度。該方法通過使用乙酸中的BT溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。接枝密度（GD）以mol of pNaSS / cm表示2PCL薄膜。

2.4 PCL表征

        使用配備折光率檢測器的 Spectra Physics P100 泵（Wyatt Technology Optilab Rex）使用尺寸排阻色譜 （SEC） 測定 PCL 數(shù)平均值和重均分子量（分別為 Mn 和 Mw）和多分散指數(shù) （PDI）。針對每種薄膜條件分析兩個樣品。將樣品溶解在四氫呋喃中，并通過2個混合C-13色譜柱（聚合物實驗室）洗脫，這些色譜柱以1 mL min的流速串聯(lián)連接−1.樣品濃度為 10 mg mL−1并使用一系列窄多分散聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品生成常規(guī)校準(zhǔn)。

        差示掃描量熱法 （DSC） 分析在氮氣氣氛下使用 131 Seratam Instrumentation 量熱儀進(jìn)行。針對每種薄膜條件分析兩個樣品。在25至200°C的加熱速率下，以10°C的很小加熱速率掃描樣品一次−1.熔融溫度（Tm）和熔融焓（ΔHm）的PCL是從第一次掃描中確定的;熔化溫度取于峰值的很大值。此后，在−100至25°C的加熱速率下，以10°C的很小加熱速率對樣品進(jìn)行兩次掃描−1.玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）在第二次掃描的中點確定。結(jié)晶度 （Xc） 使用公式 1 計算：

2.5 表面分析

接觸角 （θ） 測量采用無柄跌落法，使用 Drop Shape Analysis 軟件和 KRUSS 設(shè)備進(jìn)行。使用的液體是蒸餾水，在不同位置對每個樣品進(jìn)行 3 次測量。針對每種薄膜條件分析兩個樣品。

傅里葉變換紅外 （FTIR） 光譜以衰減全反射模式 （ATR） 記錄，使用連接到 Thermo Nicolet Avatar 6700 FTIR 并由 OMNIC 軟件控制的 SMART OMNIC 采樣器獲得。光譜是通過在 650 – 4000 cm 范圍內(nèi)累積 128 次掃描獲得的−1分辨率為 4 cm−1.背景掃描是在沒有樣品的情況下采集的。

使用環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM – Hitachi TM3000）進(jìn)行能量色散X射線光譜（EDX）分析，該顯微鏡在15 kV的加速電壓下工作，并配備EDX探頭（Hitachi SwiftED3000）。采集時間設(shè)置為 196.6 s。針對每種薄膜條件分析了三個樣品。

X射線光電子能譜（XPS）分析使用Surface Science Instruments S探針光譜儀進(jìn)行。該儀器具有單色 Al Kα X 射線和低能電子泛光槍，用于中和非導(dǎo)電樣品的電荷。起飛角度為55°。Service Physics Hawk Data Analysis 7 軟件用于計算從測量和詳細(xì)掃描中獲取的峰面積的表面原子濃度，然后使用適當(dāng)?shù)脑孛舾卸认禂?shù)進(jìn)行校正，以及高分辨率掃描的峰值擬合。通過將很低結(jié)合能C1s高分辨率峰的結(jié)合能定為285.0 eV來校準(zhǔn)高分辨率光譜的結(jié)合能尺度。對于成分分析，分析了每種樣品類型的三個不同斑點。從每個樣品的一個點采集高分辨率 C1s 掃描。

2.6 嫁接穩(wěn)定性

為了研究pNaSS接枝的穩(wěn)定性，將滅菌的薄膜浸入無菌PBS（pH = 7.1）中，并在37°C下在5%CO的加濕氣氛中孵育2在空氣中停留不同的時間段。在孵育結(jié)束時，監(jiān)測PBS的pH值，并將樣品在PBS中洗滌過夜。通過BT方法測定孵育膜上殘留的接枝pNaSS的量，并根據(jù)公式2計算：

2.7 體外檢測

滅菌后，將薄膜放置在 24 孔板的單個孔中，并用 PTFE 環(huán)稱重。將McCoy細(xì)胞在37°C下以50,000個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種到薄膜上2小時。 隨后，用補充了PenStrep（1%）和FBS（10%）的DMEM淹沒了PTFE環(huán)上方的油井。培養(yǎng)24小時后，通過改良的MTT測定法測量細(xì)胞線粒體活性[24]。PBS 中的 MTT 溶液（5 mg mL−1）加入到每個孔中，然后在37°C下孵育4小時。 孵育期結(jié)束后，小心地取出薄膜并轉(zhuǎn)移到裝有 500 μL 二氯甲烷的玻璃瓶中。薄膜完全溶解后，加入500μL二甲基亞砜，并將樣品在攪拌下放置過夜。使用分光光度計（Perkin Elmer Lambda 25）在550nm處測量光密度。在沒有細(xì)胞的培養(yǎng)物中維持的薄膜并如上分析用于背景減法。這些膠片一式三份進(jìn)行了測試。作為對照，將McCoy細(xì)胞接種在經(jīng)過商業(yè)處理的聚苯乙烯培養(yǎng)皿（TCPS）上。

對于形態(tài)學(xué)研究，所有圖像均在培養(yǎng) 48 小時后拍攝。ESEM圖像使用Hitachi TM3000 ESEM在15 kV下運行，并配備了在4 °C下運行的Peltier平臺。 對于該實驗，細(xì)胞密度為 10,000 個細(xì)胞/孔。對于熒光圖像，用Hoechst和/或phalloïdin對樣品進(jìn)行染色，并用熒光顯微鏡（AXIOLAB HBO-500，蔡司）觀察。圖像是用PROGSPOT軟件拍攝的。細(xì)胞密度為 1,000 個細(xì)胞/孔或 50,000 個細(xì)胞/孔。

2.8 統(tǒng)計分析

使用社會科學(xué)統(tǒng)計軟件包（SPSS）軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。對于每個人群，通過Kolmogorov-Smirnov檢驗檢查組正態(tài)性。通過Levene檢驗評估組間方差的同質(zhì)性，并進(jìn)行單因素方差分析以檢查均值之間的統(tǒng)計差異。很后，進(jìn)行了Tukey和Scheffe的事后測試。在所有統(tǒng)計評價中，p < 0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)論

苯乙烯磺酸鈉成功接枝到PCL薄膜表面，磺酸鹽分布均勻。結(jié)果表明，該過程不會改變PCL薄膜的內(nèi)在特性，并產(chǎn)生一層薄薄的pNaSS覆蓋層，該層被發(fā)現(xiàn)是可靠和穩(wěn)健的，因為它在孵育過程中是穩(wěn)定的。盡管pNaSS層的厚度很小，但PCL的生物活性得到了改善，因為它被發(fā)現(xiàn)接種到嫁接的PCL薄膜上的成纖維細(xì)胞具有更好的粘附性，增強(qiáng)的擴(kuò)散和更高的代謝活性。pNaSS的接枝可以有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)，似乎是開發(fā)用于組織工程應(yīng)用的生物活性聚酯基支架的良好替代方案。例如，在使用結(jié)締組織工程的前交叉韌帶重建中，很近的研究集中在開發(fā)可生物降解的結(jié)構(gòu)上，這些結(jié)構(gòu)可以允許功能性移植，同時增強(qiáng)宿主整合。根據(jù)本研究獲得的結(jié)果，基于pNaSS接枝的PCL纖維的生物活性和可生物降解的假韌帶可能是下一代合成韌帶。pNaSS接枝到PCL纖維上的研究目前正在進(jìn)行中。